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实时荧光定量PCR技术

  实验方法原理实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

  2. 两相分离 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

  3. RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

  6. 溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水4 0ul用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

  先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。

  灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 l溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1xMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

  取3 ugRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 ug/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

  上样前凝胶须预电泳5 min,随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。

  28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

  2. 混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟,取出后立即冰水浴至管内外温度一致,然后加逆转录酶0.5 ul,37℃水浴60分钟。

  3. 制备好的阳性标准品和检测样本同时上机,反应条件为:93℃2分钟,然后93℃ 1分钟,55℃ 2分钟,共40个循环。

  五、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线. 针对每一需要测量的基因,选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。

  (3)PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

  (4)将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。

  (3)将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为:93℃ 2分钟预变性,然后按93℃ 1分钟,55℃1分钟,72℃1分钟,共40做个循环,后72℃7分钟延伸。

  引物设计软件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原则:引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。

  各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,GoldView染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

  1.荧光阈值:在荧光扩增曲线指数增长长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量标准)。荧光阈值可设定在指数扩增阶段任意位置上,但实际应用要结合扩增效率,线性回归系数等参数来综合考虑。

  2.Ct值:在PCR扩增过程中,扩增产物(荧光信号)到达阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值具有极好的重复性。

  1)Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,因此Ct值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的Ct值是恒定的。

  2)Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定,因此,实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。

  外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量准确,重现性体检测等诸多领域。

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